Differential expression in “rogue” paramutation in peas (Pisum sativum L.): - from mRNA to siRNA

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014A paramutação é um fenómeno epigenético originado pela interação entre alelos que provoca alterações hereditárias na expressão génica. Embora estas interações sejam mais frequentemente observadas entre alelos do mesmo gene também existe casos onde as paramutações foram observadas entre sequências homólogas em posições não alélicas. Os mecanismos moleculares que causam este fenómeno são ainda desconhecidos, no entanto em vários casos a paramutação tem sido associada à ação de RNAs não codificantes (ncRNA), a alterações na estrutura da cromatina e à metilação do DNA. A metilação do DNA consiste na relocação de um grupo metil (CH3) de uma Sadenosil- l-metionina para o carbono 5’ da citosina ou adenina. Isto tem uma forte influência epigenética pois confere informação hereditária que não é codificada na sequência de DNA. Os ncRNAs, que podem ser divididos em várias subcategorias tais como: micro- RNAs (miRNAs), long non-coding RNAs (lncRNAs), Piwi-interacting RNAs (piRNAs); enhancer RNAs (eRNAs), promoter-associated RNAs (PARs) e small interfering RNAs (siRNAs), têm sido associados a vários mecanismos que afetam a expressão génica, na regulação transcricional e pós-transcricional. O primeiro caso de paramutação descrito foi o fenótipo Rogue em ervilheira (Pisum sativum L.), porém, os mecanismos moleculares responsáveis pelo aparecimento espontâneo e pela manutenção deste fenótipo não foram ainda esclarecidos, tal como não foram até ao momento esclarecidos, de forma inequívoca, todos os outros casos conhecidos de paramutação. No entanto, sabe-se que o cruzamento de plantas Rogue com plantas do tipo selvagem resulta unicamente em plantas F1 "rogues" e que em todas as gerações seguintes as descendências são totalmente "rogue". A herança deste fenótipo encontrase em contradição total com as regras de hereditariedade Mendeliana que preveem o aparecimento na geração F2 de pelo menos um quarto de indivíduos com o fenótipo selvagem e a duplicação desta percentagem em cada ciclo seguinte de autofecundação. Este trabalho teve como objetivo avançar no caminho de descodificação deste fenómeno, aberrante do ponto de vista da genética clássica, tentando identificar diferenças de expressão génica entre uma cultivar de ervilheira (cv.Onward, JI2722) e uma sua linha paramutada (Onward “Rogue”, line JI2723). Ambas gentilmente cedidas pelo Dr. Mike Ambrose do John Innes Institute, Reino Unido. De acordo com esse objetivo procedeu-se à extração de RNA total de folhas jovens totalmente desenvolvidas de vários indivíduos dos dois tipos de plantas com a mesma idade e cultivadas em condições o mais idênticas possível. Do RNA procedeu-se ao isolamento do RNA mensageiro a partir do qual se procedeu à síntese de cDNA monocatenário, utilizado para realizar a maioria dos trabalhos efetuados para a preparação desta dissertação. A fim de procurar diferenças na expressão génica efetuaram-se vários ensaios de Multi-RAPD Differential Display (MRDD), cuja técnica é baseada na técnica do Differential Display mas com algumas diferenças nomeadamente, omitindo o oligo-dT e substituindo a utilização de um único primer RAPD por uma combinação de quatro primers do mesmo tipo. Foram testadas 109 combinações diferentes de 4 primers RAPD, no entanto entre os mais de 700 produtos de amplificação nenhum se apresentou como polimórfico. Alguns resultados prévios que apontavam para a possível existência de polimorfismos não foram confirmados em segunda análise utilizando outras amostras biológicas. A procura de polimorfismos na expressão génica foi então direcionada para a confirmação de expressão diferencial de sequências indicadas como estando presentes em quantidades diferentes nas amostras de cDNA da cv. Onward e da sua linha paramutada (Rogue) pela análise por Suppression Subtractive Hybridization (SSH) previamente efetuada pelo Laboratório. Entre os inúmeros contigs fornecidos pela sequenciação massiva paralela (next generation sequencing) das bibliotecas geradas pela análise SSH (Santo e Leitão, resultados não publicados) foram selecionados 24 para análise neste trabalho. Desenharam-se primers que flanqueiam pequenos fragmentos (95 a 120 bp) dos 24 contigs, passiveis de serem analisados com alta eficiência pela técnica de RT-qPCR. No entanto, tendo em linha de conta a grande quantidade de sequências aparentemente expressas diferencialmente identificadas pela técnica SSH, e os maiores requisitos em tempo, recursos humanos e materiais, da técnica de RT-qPCR, procedeuse à avaliação prévia, mas menos precisa, da expressão diferencial das 24 sequências pela comparação dos produtos da amplificação com menos ciclos (25 ciclos) por PCR. A validação deste teste prévio, teve como objetivo estabelecer um procedimento de seleção que permita dar prioridade na análise por RT-qPCR às sequências com maior probabilidade de apresentarem diferenças significativas de expressão. Procede-se em paralelo a amplificações por 35 ciclos que serviram de controlo aos resultados das amplificações por 25 ciclos. A comparação dos resultados por amplificação por RT-qPCR e os resultados da amplificação prévia por 25 ciclos de PCR demonstrou uma forte correlação entre estes dois tipos de análise, o que permitirá focar as análises por RT-qPCR nas sequências melhores candidatas a apresentarem diferenças significativas na sua expressão. Os resultados da análise RT-PCR permitiram identificar diferenças na expressão de 11 sequências, das quais 8 com diferenças significativas e que poderão estar associadas a mecanismos moleculares relacionados com a paramutação. No entanto estes resultados terão de ser confirmados utilizando amostras biológicas adicionais. Estudos recentemente desenvolvidos no Laboratório (Santo e Leitão, resultados não publicados) provaram a existência de metilação diferencial de sequências genómicas específicas nas folhas e no pólen de plantas da cv. Onward e linha Rogue. Estes dados chamam a atenção para os genes relacionados com metilação de DNA e modificações da cromatina e para possíveis alterações na sua expressão no processo de paramutação. Não sendo conhecida a sequência destes genes em Pisum sativum torna-se necessário identificar, pelo menos de forma parcial, a sequência exata de alguns desses genes nesta espécie antes de se proceder à análise da sua expressão dos mesmos em plantas rogues e não-rogues. Com base nos dados genómicos referentes a esses genes em Medicago truncatula (http://www.jcvi.org/medicago) foram sintetizados primers que permitiram amplificar algumas regiões dos genes ddm1, drm2 e mop1 em ervilheira, que foram confirmadas com elevada similaridade com as sequências dos mesmos genes em M. truncatula e Cicer arietinum (grão de bico) e em particular com elevada similaridade das sequências proteicas que estas codificam (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Estas sequências serão utilizadas em breve para avaliar a expressão diferencial destes genes em plantas paramutadas (Rogue) e nãoparamutadas (cv. Onward) de ervilheira. A paramutação tem sido associada a mecanismos de metilação de DNA dirigidos por RNA (RNA directed DNA methylation - RdDM) pelo que demos inicio ao estudo comparativo das classes de siRNA presentes em plantas paramutadas e nãoparamutadas. Com esse objetivo procedeu-se ao isolamento de siRNA em plantas Onward e Rogue, separando o RNA total em duas frações distintas (alto peso molecular e baixo peso molecular) por precipitação fraccional com PEG e NaCl e à ligação de adaptadores RNA à fração de baixo peso molecular. O cDNA resultante dos siRNA ligado aos adaptadores foi amplificado por PCR durante 35 ciclos e durante 6 ciclos, respetivamente para visualização e para excisão (recuperação) em gel de agarose. A região entre os 71 e 76 bp (siRNA mais adaptadores) foi purificada para futura validação e posterior analise após sequenciação massiva paralela. No entanto, o estudo da expressão génica diferencial por via da análise das sequências previamente identificadas pela técnica de Suppression Subtractive Hybridization (SSH) parece ser bastante prometedor e passível de identificar alterações de cadeias metabólicas associadas ao estabelecimento e manutenção da paramutação, pelo que se apresente como prioritário e urge ser rapidamente continuado